Doctorat sur le Mécanisme de la Réplication Bactérienne H/F - 78

Étude des rôles de la bidirectionnalité de la réplication dans les bactéries

Le projet de thèse vise à déterminer la part que jouent la réplication unidirectionnelle du chromosome et le problème topologique causé par une initiation unidirectionnelle de la réplication dans l'arrêt de la prolifération induit par la déplétion en DciA. Le travail de thèse sera divisé en deux parties, (i) l'analyse des conséquences de la déplétion en DciA à l'échelle de la cellule unique et (ii) l'analyse de contextes génétiques permettant de différencier les problèmes induits par une initiation unidirectionnelle de la réplication de ceux induits par une élongation unidirectionnelle.
(i) Le doctorant utilisera un système d'étiquette fluorescente en place au laboratoire pour suivre les conséquences de la déplétion en DciA sur la réplication au niveau de chaque par microscopie pour les données obtenues sur des populations, qui suggère une réplication bidirectionnelle dans 2/3 des cas dans les cellules déplétés en DCiA (David et al, 2014).
(ii) Le doctorant utilisera le système ter/Tus de terminaison de la réplication de E. coli pour créer une souche dans laquelle l'initiation de la réplication sera bidirectionnelle mais l'élongation de la réplication sera bloquée d'un côté de l'origine. Le doctorant utilisera des souches portant des mutations dans RecB et PriA, deux acteurs majeurs du redémarrage des fourches, pour empêcher le démarrage de la réplication du côté de l'origine bloqué par la déplétion en DciA. Après construction de ces contextes, le doctorant analysera la viabilité des cellules et le programme de réplication au niveau de la population.
Contexte de travail
L'équipe "Evolution et maintenance des Chromosomes circulaires" étudie les systèmes de maintien de l'information génétique dans les bactéries. Au cours du cycle cellulaire, les processus de réplication de l'ADN, de ségrégation de l'ADN et de division cellulaire doivent être coordonnés pour assurer le succès de la descendance. La réplication de l'ADN nécessite la séparation des deux brins parentaux. Cette fonction est effectuée par la progression sur un seul brin d'un complexe protéique en forme d'anneau, l'hélicase replicative. En interaction avec cette hélicase, la machinerie de réplication peut alors synthétiser le brin complémentaire de chaque brin parental. Chez les bactéries, l'initiation de la réplication du chromosome à partir d'origine unique, oriC, est le point clef du cycle cellulaire. L'initiation est bidirectionnelle. Deux hélicases réplicatives sont chargées en orientation opposée sur oriC. Le chargement des hélicases réplicatives est stimulé in vitro par un co-facteur, la protéine DciA (Marsin et al, 2021). Nous avons montré grâce à des analyses très sensibles de contenu génomique d'une population que la déplétion en DciA conduit à une initiation unidirectionnelle de la réplication, ce qui cause un problème topologique. Un système alternatif de démarrage rapide permet dans environ 2/3 des cas de conserver une réplication bidirectionnelle. Néanmoins, la viabilité des cellules déplétées en DciA est fortement altérée. La prolifération diminue progressivement et s'arrête après une vingtaine de cycle réplicatif (Besombes et al, 2024). Ces résultats révèlent l'importance du caractère bidirectionnelle de la réplication.
Contraintes et risques
Il n'y a pas de risques autre que ceux attenant à la biologie moléculaire.
La langue de travail de l'équipe est l'anglais.